Purification des protéines, un procédé qui peut se révéler aussi simple que complexe
Purifier une protéine semble simple : autant pour une protéine taggée Histidine ou GST ou pour une immunoglobuline une étape d’affinité suivi d’un polishing est suffisant, autant pour les autres protéines, le procédé est beaucoup plus complexe.
Nous allons vous exposer la stratégie de purification CEP : Capture – Enhance – Polishing
Quelques points clefs sont à garder en mémoire :
- La stabilité des protéines
- Quelle sera l’utilisation des protéines
- Les outils de purification
- Les techniques séparatives
- Les propriétés des protéines
- Le planning de la purification
Stabilité des protéines
Avant toute purification de protéines, il est nécessaire de se rappeler qu’elles risquent de perdre tout ou partie de leur activité.
Les risques sont dus à :
- La présence d’inhibiteurs
- La présence d’enzymes protéolytiques
- La perte de leur structure
- Leur aggregation/précipitation
- Leur perte (adsorption non-spécifiques)
- Modifications chimiques
Pour limiter ces risques au maximum, il faut éviter :
- Les purifications comportant de trop nombreuses étapes
- Un stockage prolongé
- Les phases de congélation/décongélation
Et au contraire, il faut :
- Optimiser les conditions de purification
- Travailler à des températures faibles
- Optimiser les concentrations
- Eliminer les protéases
- Ajouter des agents stabilisants et des co-facteurs
A quelle application est destinée la protéine purifiée ?
En fonction de l’utilisation de la protéine, les stratégies de purifications seront différentes.
Outils pour les purifications préparatives
En fonction des quantités de protéines désirées, les outils de purification sont très différents.
Les techniques chromatographiques à notre disposition pour les purifications protéiques
Propriétés des protéines
Toutes ces techniques peuvent être utilisées car toutes les protéines, à des degrés divers, possèdent des zones chargées négativement, des zones chargées positivement, des zones hydrophiles, des zones hydrophobes et des zones présentant des affinités pour divers marqueurs.
Le planning
1/ Définir l’objectif
- Cible désirée
- Conditions expérimentales
2 / Décrire
- La protéine à purifier
- Le matériel de départ (milieu dans lequel la protéine est présente)
3/ Développer les conditions analytiques
La stratégie CEP BioWorks
La stratégie CEP : comment combiner les techniques séparatives
Il faut :
- Associer des techniques complémentaires
- Réduire la manipulation des échantillons.
En général 3 étapes de purification sont un maximum. Au delà, la perte de protéine cible est trop importante et le rapport pureté/coût n’est plus intéressant.
Les étapes de purification :
“Don´t waste clean thinking on dirty enzymes” Efraim Racker
Keep it simple !
Résumé de la stratégie CEP
Dans la stratégie CEP BioWorks, le planning va permettre de définir parfaitement les conditions de la purification du matériel de départ au produit final : dans quel milieu se trouve la protéine à purifier, quelle est elle (Immunoglobuline, protéine recombinante…), qu’allons nous en faire à l’issu de la purification, quelles sont les techniques de purifications les plus pertinentes.
Les diverses étapes de développement vont permettre de valider les techniques de purification, de valider les supports de purification et enfin d’optimiser les conditions opératoires (pH, forces ioniques, températures, vitesses de travail…).
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